Статьи

В.И. Лучшев, Т.Я. Чернобровкина, С.Н. Жаров

Кафедра инфекционных болезней, тропической медицины и эпидемиологии,  ГОУ ВПО «РГМУ МЗ РФ» (зав. кафедрой – проф. В.И. Лучшев)

 Введение

Из литературных источников известно, что геном вируса гепатита С (ВГС) кодирует три структурных белка: протеин С (core, ядерный), Е1 и Е2 (протеины оболочки) и четыре неструктурных белка: NS2, NS3, NS4 (A,B), NS5 (A,B). К каждому из белков в организме человека вырабатываются антитела, циркулирующие в крови. В настоящее время предлагается широкий спектр современных иммунологических и молекулярно-биологических диагностических тест-систем, а также гистологических исследований печени для выявления антительных, антигенных маркеров и RNA вируса гепатита С, различающихся своей чувствительностью и специфичностью [1, 2, 5, 8, 10]. Наиболее ранним маркером инфекции является обнаружение в сыворотке крови RNA-HCV через 1-3 недели от момента инфицирования. Однако, положительная RNA-HCV в сыворотке крови регистрируется только у 25% инфицированных ВГС на фоне нормальных уровней активности трансаминаз, поэтому чаще заболевание длительное время не диагностируется [2].

Обычно антитела к структурным белкам выявляются в сыворотке крови через 6-8 недель от инфицирования, причем они не обладают вируснейтрализующими свойствами, достаточными для элиминации вируса. Именно белки внешней оболочки (Е1 и Е2) ВГС имеют участки с высокой частотой аминокислотных замен, в результате которых образуются большое число генотипов и субтипов. Антитела к неструктурным белкам определяются в сыворотке крови несколько позже (через 10 недель от начала болезни) [3, 4, 5, 6]. В литературе появляется все больше данных о предполагаемых функциях и прогностическом значение как антигенов так и антител к ВГС. Считают, что нуклеокапсидный белок  активирует апоптоз инфицированных клеток, способствует увеличению числа рецепторов апоптоза на клеточной мембране гепатоцита и повышению чувствительности клетки к проапоптотическим стимулам. Так, за чувствительность к интерферону возможно отвечает NS5 (A,B) белок. Высокий титр  антител к поверхностным (структурным) белкам в острой фазе заболевания   характеризует благоприятное течение HCV-инфекции [3]. Отсутствие антител к NS5 белку у больных ОГС характерно для периода реконвалесценции [5].  Выявление анти-NS4 ассоциируется с поздними морфологическими стадиями болезни – циррозом печени [4, 7, 9]. Диагностическая интерпретация антител к NS3 неструктурному белку  по данным литературы неоднозначна. Кроме того, данные о маркерах вируса С изучались в образцах сыворотки крови больных в основном при моно инфекции HCV. Однако, доказанная репликация ВГС  не только в клетках печени, но и в клетках эпителия, кератиноцитах, лимфоидных клетках и даже клетках крови послужила основанием для исследования маркеров ВГС на эритроцитах крови больных [7, 11].

 Поэтому целью нашей работы являлось усовершенствование дифференциальной диагностики НСV-инфекции на основании исследования антител к структурным и неструктурным белкам ВГС не только в сыворотке, но и на эритроцитах крови больных.

Материалы и методы

 Изучение клинической картины, лабораторных показателей и антителогенеза проводилось у 57 больных, страдающих HCV-инфекцией и микст-инфекцией HCV + HBV. Первую группу пациентов получавших базисную терапию, составили 17 больных с острым гепатитом С (ОГС), вторую 15 с обострением хронического гепатита С (ХГС), третью 25 пациентов  с микст-инфекцией HCV+HBV по типу супер-инфекции острый гепатит В на фоне хронического гепатита С (ОГВ+ХГС). Пациенты находились на стационарном лечении в Инфекционной клинической больнице №3 г. Москвы (главный врач – Лазуткина Л.И.).

Верификацию вирусных гепатитов проводили с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Определение спектра антител класса IgM и IgG к вирусу гепатита С в сыворотке и на эритроцитах крови проводилось методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем «ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР» и  «ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР- GM» НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород). Исследование крови пациентов проводилось в день госпитализации, через 1 месяц. ИФА проводился строго по инструкции прилагаемой к каждой тест-системе с поэтапным добавлением в лунки планшета готовых реагентов. В основе метода лежит реакция рекомбинантных антигенов, сорбированных раздельно на стрипах полистиролового планшета с антителами в исследуемых сыворотках и на эритроцитах крови больных HCV-инфекцией. Венозную кровь брали из локтевой вены натощак и центрифугировали 5 минут с 1500 оборотов в минуту. Сыворотку крови отделяли, помещали в пластиковые контейнеры и хранили в морозильной камере. Верификацию вирусных гепатитов проводили с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Оставшийся осадок так же помещали в морозильную камеру. Перед постановкой реакции, сыворотки крови пациентов размораживались, а осадок крови трижды центрифугировали с физиологическим раствором (0,9% NaCl) в течение 5 минут с частотой  1500 оборотов в минуту с целью приготовления отмытых разрушенных эритроцитов.

Учет результатов проводили спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Рассчитывалась критическая оптическая плотность  (ОП) каждого антигена по формуле:

ОП крит. core-Ag = среднее значение ОП К- (core) + 0,2

Где 0,2 –  коэффициент, определяемый методом статистической обработки результатов на предприятии-изготовителе, а «К» - это жидкий отрицательный контрольный образец – сыворотки крови человека, не содержащая антитела к HCV, антитела к ВИЧ-1, 2, HbsAg и инактивированная прогреванием в течение 3-х часов при температуре 56 градусов по Цельсию.

Реакция считалась положительной при превышении результата над показателем критической ОП не менее чем на 20%.

ИФА проводился в лаборатории кафедры инфекционных болезней, тропической медицины и эпидемиологии РГМУ на базе клинической инфекционной больницы №3.

Результаты и обсуждение

При исследовании спектра маркеров HCV-инфекции в сыворотке и на эритроцитах крови, в условиях динамического наблюдения за больными получены следующие результаты.

У всех больных с моно-HCV-инфекцией при госпитализации в стационар обнаруживаются антитела к ядерному белку ВГС (100%) и в несколько меньшем проценте (84%) у пациентов с микст-инфекцией ОГВ+ХГС.  В динамике заболевания сохраняется 100% выявляемость этих антител во всех группах (табл. 1).

 Таким образом, наличие антител к core-белку в сыворотке крови практически у всех больных при поступлении в стационар и после базисной терапии может свидетельствовать о наличии у пациента только HCV-инфекции, не указывая на длительность течения и период заболевания. Следовательно, характерный спектр антител к структурному core-белку в сыворотке крови больных будет недостаточным для дифференциальной диагностики HCV-инфекции.

Параллельное определение спектра антител на эритроцитах крови показало, что в них сохраняется наибольшая выявляемость  антител к core-белку  у всех больных в период разгара и  в период реконвалесценции у пациентов с ХГС и микст-инфекцией, в противоположность ОГС (20%, р<0,02), что позволяет при одновременном сопоставлении  с сывороточным спектром антител к ядерному core белку  с большей вероятностью разграничить острое и хроническое течение  HCV-инфекции (табл. 2).

Отмечается 100% определяемость антител к NS3 белку ВГС в сыворотке у больных с ОГС и несколько меньшая частота у пациентов с ХГС (86,6%) при поступлении в стационар. Достоверно меньшая частота встречаемости антител к NS3 белку (68%) зарегистрирована у пациентов с микст-инфекцией ОГВ+ХГС по сравнению с ОГС (р<0,001). В динамике заболевания наблюдается достоверное увеличение частоты встречаемости антител к NS3 белку в сыворотке крови только в группе пациентов с микст-инфекцией ОГВ+ХГС (р<0,02). Таким образом, только по сывороточному спектру антител к NS3 белку у пациентов в сравниваемых группах нельзя предположить длительность течения заболевания, а можно только установить факт инфицирования вирусом гепатита С.

Однако при исследовании этих антител на эритроцитах крови достоверно низкий процент встречаемости анти- NS3 наблюдается у пациентов с ОГС и микст-инфекцией ОГВ+ХГС по сравнению с ХГС в период реконвалесценции (р<0,05). Следовательно, низкий процент встречаемости антител к NS3 белку у больных на эритроцитах крови в противоположность высокому сывороточному уровню позволяет предположить острое течение заболевания.  В случае же сочетанного вирусного поражения печени, по-видимому, имеет место взаимоингибирование ВГВ над ВГС.

Таким образом, выявленные изменения антителогенеза к ядерному и неструктурному NS3 белкам при совместном определении в сыворотке и на эритроцитах крови позволяют с большей достоверностью сориентировать практического врача в дифференциальной диагностике и возможно в прогнозе заболевания.

Достоверных различий при сравнении антител к NS4 белку в сыворотке крови в сравниваемых группах в период разгара не выявлено. В период ранней реконвалесценции отмечается тенденция к снижению частоты встречаемости антител к NS4 белку у больных с ОГС, без достоверных отличий. Увеличение процента встречаемости антител к NS4 белку отмечается у пациентов с ХГС и микст-инфекцией ОГВ+ХГС, причем при микст-инфекции это увеличение является достоверным по сравнению с показателем при поступлением (р<0,05).

При сравнении частоты встречаемости антител к NS4 белку в сыворотке крови через 1 месяц у больных ОГС отмечается достоверно меньший процент, по сравнению с другими группами, что с большей вероятностью позволяет предположить благоприятное течение HCV-инфекции (р<0,02). С другой стороны, на эритроцитах тех же больных (ОГС) в период разгара и реконвалесценции эти антитела не выявляются. Таким образом, соотношение уровня этих антител в сыворотке и на эритроцитах может дать определенную информацию о стадии заболевания.

 Практически похожая картина уровней антител отмечается при изучении динамики антител к NS5 белку. Отсутствие этих антител на эритроцитах выявлено у пациентов ОГС независимо от периода заболевания. Следовательно, их отсутствие в сыворотке и на эритроцитах может служить возможным указателем на острый характер заболевания.

Выводы

1. Полученные результаты свидетельствуют о том, что  сыворотка крови и эритроциты больных HCV-инфекцией различаются по спектру антител и этот спектр зависит не только от длительности течения заболевания, но и от периода заболевания.

2. Полученные данные показывают необходимость одновременного определения антител как к структурным, так и неструктурным белкам ВГС как в сыворотке так и на эритроцитах крови пациентов.

3. Высокая чувствительность иммуноферментного метода, позволяющая определять наличие антител на эритроцитах крови, наряду с технической простотой выполнения, высокой скоростью исследования и низкой стоимостью позволяют  использовать этот метод в стационарных и амбулаторных условиях.